Визуализация клеточных данных с помощью флуоресцентной микроскопии

Контент от Bruker Nano Surfaces and Metrology                                                                                             12 мая 2020 г.

Флуоресцентная микроскопия широко используется для изучения биологических систем в основном из-за её специфичности, способности воздействовать на отдельные структуры и высокого соотношения сигнала и фона. В последнее время развитие флуоресцентной микроскопии позволило наблюдать за клетками на нанометровом уровне, что намного ниже дифракционного предела разрешения традиционных методов1.

Рисунок 1. Принцип работы DNA-PAINT. Целевой белок (тубулин) помечается антителом, меченым олигонуклеотидом стыковочной цепи. Затем образец погружается в олигонуклеотиды визуализирующей цепи. Временное связывание флуоресцентно помеченной визуализирующей цепи со стыковочной цепью приводит к тому, что образец начинает «мигать», что затем можно локализовать с помощью программного обеспечения Vutara SRX. Изображение предоставлено компанией Bruker Nano Surfaces

Эти разработки проложили путь в область микроскопии сверхвысокого разрешения. Эта новая область уже оказала настолько долгосрочное влияние на научное сообщество, что две её методики были удостоены Нобелевской премии по химии в 2014 году,2-4 а инструменты стали коммерчески доступными, например микроскоп сверхвысокого разрешения Vutara 352 от Bruker для визуализации отдельных молекул.

Однако эти методы неидеальны. Все они имеют определённые ограничения и постоянно совершенствуются, чтобы расширить их возможности. Например, методы, основанные на стохастическом переключении флуорофоров, также известные как микроскопия локализации одиночных молекул (SMLM, синонимы STORM, dSTORM, PALM и т. д.), сталкиваются с проблемами при многоцветной визуализации с использованием спектрально различных флуорофоров.

Рисунок 2. Метод DNA-PAINT обеспечивает точность локализации менее 10 нм, что делает его одним из самых точных методов микроскопии. Слева показан эксперимент DNA-PAINT, проведённый на микроскопе Vutara 352 с иммерсионным объективом 1,2 NA. На изображении показана вся сеть тубулинов в клетке BS-C-1, помеченная вторичными антителами, конъюгированными со вторичным антителом DNA-PAINT. Справа показан увеличенный фрагмент сети тубулинов (область в рамке). Хорошо виден просвет микротрубочки. Изображение предоставлено компанией Bruker Nano Surfaces

В основном это связано с отсутствием доступных флуорофоров с желаемыми свойствами фотопереключения5. Было проведено множество исследований, направленных на решение этой проблемы с помощью новых подходов, основанных на использовании одной молекулы.

Один из таких подходов, который был представлен, — DNA-PAINT (Points Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography), который позволяет локализовать отдельные молекулы за счёт связывания коротких (<10 нуклеотидов) олигонуклеотидов, меченных флуорофором, с комплементарным олигонуклеотидом, связанным с целевой молекулой, обычно с антителом или нанобелком6,7.

Связывание коротких олигонуклеотидов носит временный характер и, таким образом, создаёт эффект мерцания, аналогичный dSTORM или PALM, без необходимости в уникальном фотопереключаемом флуорофоре, как показано на рисунке 1. Метод DNA -PAINT имеет множество преимуществ по сравнению с альтернативными методами мерцания. Мерцание обычно длится дольше, чем в традиционном dSTORM, что приводит к более высокому выходу фотонов из флуорофора.

Рисунок 3. Метод DNA-PAINT обладает огромным потенциалом для мультиплексной визуализации с использованием Vutara и его интегрированного жидкостного блока. Использование ортогональных стыковочных нитей на разных зондах позволяет работать с потенциально неограниченным количеством мишеней. На верхнем изображении показан двухцветный эксперимент DNA-PAINT, проведённый на микроскопе для локализации одиночных молекул Vutara 352. Тубулин окрашен в голубой цвет, а клатрин — в пурпурный. Из-за того, что DNA-PAINT не поддаётся отбеливанию, возможны большие Z-стеки (внизу). Изображение предоставлено компанией Bruker Nano Surfaces

Следовательно, он обеспечивает гораздо более высокую точность локализации (<10 нм) по сравнению с такими методами, как dSTORM и PALM. Это видно на рисунке 2. Во время визуализации образец погружается в избыток флуорофора, что обеспечивает очень длительную визуализацию и практически исключает обесцвечивание сигнала.

Специфичность мишени определяется последовательностью нуклеотидов, поэтому многие мишени можно пометить с помощью различных олигонуклеотидных последовательностей, что обеспечивает неограниченные возможности мультиплексирования с помощью DNA-PAINT. Учитывая эти преимущества, микрофлюидный блок Bruker Vutara может вымывать из образца нить визуализации для данной мишени и добавлять новые нити визуализации для новых биологических мишеней. Это показано на рисунке 3.

Развитие таких методик, как DNA-PAINT, а также совершенствование имеющихся в продаже инструментов и оборудования делают эти методы гораздо более доступными для исследователей.

Ссылки

1. Аббе, Э. Вклад в теорию микроскопа и микроскопического восприятия: I. Создание микроскопов на основе теории. Архив микроскопической анатомии 9, 413–418 (1873).
2. Бетциг Э. Нобелевская лекция: одиночные молекулы, клетки и оптика сверхвысокого разрешения. Reviews of Modern Physics 87, 1153-1168 (2015).
3. Ад, С. В. Нобелевская лекция: наноскопия со свободно распространяющимся светом. Обзоры современной физики 87, 1169-1181 (2015).
4. Мёрнер, У. Э. Нобелевская лекция: одномолекулярная спектроскопия, визуализация и фотоконтроль: основы микроскопии сверхвысокого разрешения. Обзоры современной физики 87, 1183-1212 (2015).
5. Демпси, Дж. Т., Вон, Дж. К., Чен, К. Х., Бейтс, М. и Чжуан, С. Оценка флуорофоров для достижения оптимальных результатов при визуализации сверхвысокого разрешения на основе локализации. Nat. Methods 8, 1027-1036 (2011).
6. Юнгманн Р., Штайнхаузер К., Шайбле М., Кузык А., Тиннефельд П. и Зиммель Ф. К. Кинетика отдельных молекул и микроскопия сверхвысокого разрешения с помощью флуоресцентной визуализации кратковременного связывания на ДНК-оригами. Nano Letters 10 11, 4756-4761 (2010).
7. Юнгманн Р., Авенданьо М. С., Вёрштайн Дж. Б., Дай М., Ши В. М. и Инь П. Мультиплексированная трёхмерная визуализация клеток со сверхвысоким разрешением с помощью DNA-PAINT и Exchange-PAINT. Nature Methods 11 3, 313–8 (2014).
8. Благодарности. Эта статья была написана Лорен Ганьон, специалистом по применению флуоресцентной микроскопии.

О наноповерхностях Bruker

Компания Bruker производит высокопроизводительные научные приборы, которые позволяют учёным изучать жизнь и материалы на молекулярном, клеточном и микроскопическом уровнях. Набор специализированных решений Bruker для медико-биологических исследований включает в себя широкий спектр многофотонных флуоресцентных микроскопов, микроскопов для локализации отдельных молекул (SML) со сверхвысоким разрешением и атомно-силовых микроскопов (BioAFM), ориентированных на биологию.