Микроводоросли — это фотосинтезирующие организмы, которые растут в водных системах. Они преобразуют атмосферный CO2 в органические молекулы, такие как липиды, углеводы и другие биологически активные соединения.
Эти биологические свойства означают, что микроводоросли представляют собой возобновляемый и устойчивый источник пищевых ингредиентов. К ним относятся омега-3, не содержащие животных жиров, альтернативные белки и натуральные пигменты, используемые в пищевой промышленности и производстве напитков.
Потенциал микроводорослей в удовлетворении пищевых потребностей привлек внимание пищевой промышленности. Европейское агентство по безопасности пищевых продуктов (EFSA) заявило, что спрос на натуральные пищевые пигменты растет среди потребителей, которые предпочитают натуральные продукты потенциально токсичным синтетическим пищевым добавкам.1
Однако натуральные пигменты могут быть чувствительны к воздействию света и менять цвет при определенных условиях окружающей среды, таких как температура и pH. Кроме того, они, как правило, доступны только в ограниченном диапазоне цветов. Все вышеперечисленные факторы стимулируют исследования в области использования новых натуральных пигментов в качестве пищевых красителей.
Для выявления пигментов микроводорослей, обладающих ценными свойствами для пищевой промышленности, требуется высокопроизводительная автоматизация для быстрого тестирования множества штаммов микроводорослей.
Используя эту технологию, лаборатория Fermentalg® задействовала метаболизм Galdieria sulphuraria для создания натурального синего пигмента, богатого C-фикоцианином. Этот пигмент извлекается и продается под названием BLUE ORIGINS®.2
BLUE ORIGINS® — это натуральный пигмент с полезными свойствами, в том числе устойчивый к высоким температурам и низкому pH по сравнению с другими красителями на основе микроводорослей. Он хорошо подходит для различных сфер применения в пищевой промышленности и производстве напитков, включая напитки, конфеты и готовые к употреблению хлопья.
С-фикоцианин в настоящее время является единственным синим пигментом в списке продуктов, не подпадающих под действие пищевых красителей FDA, что означает, что он подходит для производства натуральных продуктов.3
Ученые из Fermentalg® разработали инновационные методы скрининга и отбора штаммов микроводорослей с помощью прибора для отбора микробных колоний QPix 420 (от Molecular Devices®).
Обычно отбор колоний проводится вручную с помощью стерильных наконечников для пипеток или инокуляционных петель. Это делает процесс медленным и трудоёмким.
Система QPix 420 обеспечивает высокую производительность при сборе колоний: более 3000 колоний за час и эффективность сбора более 98%.
Набор флуоресцентных фильтров обеспечивает повышенную гибкость системы и удобство работы, что позволяет проводить фенотипический отбор уникальных колоний на основе морфологических особенностей и уровня флуоресцентных пигментов или экспрессии флуоресцентных белков.
Преимущества флуоресценции на QPix® 420
- Количественный флуоресцентный скрининг позволяет эффективно и объективно отбирать уникальные клоны
- Сохраняйте последующую клональную целостность во время биопроизводства
- Экспериментальная гибкость повышается благодаря разнообразию наборов флуоресцентных фильтров
- Простое программное обеспечение обеспечивает выбор правильной колонии на основе заданных параметров эксперимента
Материалы и методы
В ходе поиска штамма Galdieria sulphuraria, вырабатывающего большое количество C-фикоцианина, компания Fermentalg® получила и сохранила несколько вариантов с разным содержанием C-фикоцианина.
Эти штаммы были посеяны на среду Гросса-агара (с pH 3) и инкубировались в течение двух недель при температуре 37 °C и влажности 60% в темноте.4
Визуализация и анализ всех пластин проводились с помощью системы QPix 420, которая обеспечивает быструю работу. Использование подходящего типа штифтов гарантирует совместимость с различными микроорганизмами. В данном случае для отбора и инокуляции колоний G. sulphuraria использовались штифты в форме рождественской ёлки.
Стерильность сохранялась благодаря трём промывочным ваннам для дезинфекции штифтов, как показано на рисунке 1.
Рисунок 1. Рабочий процесс скрининга колоний с помощью системы QPix 420. Изображение предоставлено: Molecular Devices UK Ltd
Результаты
Флуоресцентный метод для выявления колоний G. sulphuraria
Для отбора колоний микроводорослей Galdieria sulphuraria был использован метод флуоресценции. Этот организм богат C-фикоцианином — водорастворимым белком, содержащимся в сине-зелёных водорослях. Этот белок отвечает за характерный ярко-синий цвет водорослей.
C-фикоцианин излучает флуоресценцию с пиком на длине волны 642 нм при возбуждении красным светом.5
Колонии G. sulphuraria возрастом две недели были сфотографированы и исследованы в проходящем свете и в режиме флуоресценции с помощью системы QPix 420, которая позволяет объективно идентифицировать и отбирать колонии, вырабатывающие интересующий нас флуоресцентный пигмент (в данном случае C-фикоцианин).
Сначала с помощью программного обеспечения QPix Fusion получают тестовое изображение пластины в проходящем свете и с выбранной флуоресценцией (как показано на рисунках 2A и 2B соответственно). Тестовые изображения можно изменять, задавая параметры получения изображения, например время экспозиции.
Обнаруженные колонии визуализируются с помощью зелёного наложения, создаваемого программным алгоритмом в соответствии с каждой обнаруженной особенностью.
Рисунок 2. (A) Тестовый снимок микроводоросли G. sulphuraria в проходящем свете. QPix Fusion Software™ показывает обнаруженные объекты, накладывая на каждую колонию зелёное покрытие. (B) Тестовый снимок того же образца был сделан в канале флуоресценции (фильтр Ex/Em: 628/692 нм) для обнаружения колоний, экспрессирующих C-фикоцианин. Изображение предоставлено: Molecular Devices UK Ltd
После получения изображений программа QPix Fusion анализирует их на основе свойств объектов. Программа определяет расположение отдельных колоний на чашке Петри (чашке Петри, планшете QT или Omnitray).
Гибкость программного обеспечения Fusion позволяет пользователю задавать желаемую морфологию колоний, включая компактность, размер колонии, диаметр, соотношение осей и минимальную близость.
Отобранные колонии G. sulphuraria были либо включены (как показано на рисунке 3 жёлтым цветом), либо исключены (как показано на рисунке 3 оранжевым цветом) в зависимости от критериев отбора.
Рисунок 3. Подходящие для отбора колонии выделены желтым цветом. Оранжевый: колонии, исключенные в соответствии с критериями отбора. Верхняя правая панель: критерии отбора, определенные для точного отбора колоний. Изображение предоставлено: Molecular Devices UK Ltd
Количественный и настраиваемый порог интенсивности флуоресценции определяет желаемый уровень экспрессии белка. Диапазон флуоресценции необходимо настроить таким образом, чтобы отбирать клетки с наибольшей концентрацией C-фикоцианина.
Для этого эксперимента были выбраны колонии, вырабатывающие C-фикоцианин со средней интенсивностью флуоресценции (MFI) от 36 000 до 43 000 (как показано на рисунках 4A и 4B соответственно).
После отбора по заданным пользователем критериям колонии были тщательно отобраны с помощью системы QPix 420.
Отбор и выявление колоний с высокой экспрессией C-фикоцианина
Различные штаммы G. sulphuraria, вырабатывающие разные концентрации C-фикоцианина, были проанализированы с помощью системы QPix 420, чтобы проверить способность системы идентифицировать и выделять колонии с высокой экспрессией C-фикоцианина, которые выглядят тёмно-зелёными (как показано на рисунке 5A).
Результаты оказались ожидаемыми: колонии с наименьшей концентрацией C-фикоцианина на агаровых пластинах выглядели белыми, а колонии со средним уровнем пигмента — светло-зелёными.
Затем с помощью QPix 420 были получены изображения различных штаммов в проходящем свете, которые впоследствии были проанализированы на основе флуоресценции C-фикоцианина (как показано на рисунке 5B-C).
Был обнаружен флуоресцентный сигнал для колоний тёмно-зелёного и светло-зелёного цвета. Успешный отбор и сбор колоний тёмно-зелёного цвета были проведены на основе ранее протестированных значений средней интенсивности флуоресценции в диапазоне от 36 000 до 43 000.
Исчезновение белых колоний при флуоресцентной визуализации подтвердило отсутствие C-фикоцианина в этой популяции микроводорослей.
Заключение
Интерес к микроводорослям в пищевой промышленности растет в связи с повышенным спросом на экологически чистые и натуральные пищевые ингредиенты.
Компания Fermentalg® использует метаболизм микроводорослей для разработки и отбора нескольких штаммов G. sulphuraria, вырабатывающих натуральный синий пигмент, устойчивый к высоким температурам и низкому pH, в качестве пищевого ингредиента (BLUE ORIGINS®).
Чтобы ускорить внедрение этого продукта в промышленность, был проведён автоматизированный скрининг колоний G. sulphuraria.
Высокопроизводительный отбор колоний обеспечивает существенные преимущества по сравнению с традиционными методами скрининга, такими как более быстрая идентификация нужных клонов, что упрощает последующий анализ.
Возможности флуоресценции QPix 420 были использованы для отбора клонов, вырабатывающих наибольшие концентрации C-фикоцианина, что ускорило масштабирование производства натурального пигмента на основе микроводорослей.
В целом, автоматизация с высокой пропускной способностью открывает большие перспективы для будущего развития производства микроводорослевых продуктов.
Благодарности
Создано на основе материалов, изначально написанных Каролой Манчини из Molecular Devices, Одри С. Коммо, Родриго Ранхелем и Жюльеном Демолем из Fermentalg.
Ссылки и дальнейшее чтение
- Карочо М. и др. Добавление молекул в пищу, плюсы и минусы: обзор синтетических и натуральных пищевых добавок. Compr Rev Food Sci Food Saf. 2014 Jul;13(4):377-399. doi: 10.1111/1541-4337.12065. PMID: 33412697
- Атан и др., Оценка безопасности обогащенного фикоцианином экстракта Galdieria sulphuraria с использованием 90-дневного исследования токсичности на крысах и исследований генотоксичности in vitro. Исследования в области токсикологии и их применение, 2020.
- Минси Ван и др., «Сравнение C-фикоцианина из экстремофильных Galdieria sulphuraria и Spirulina platensis по стабильности и антиоксидантной способности», Algal Research, 2021, том 58.
- Гросс В. и Шнарренбергер К. (1995): Гетеротрофный рост двух штаммов кислотно-термофильной красной водоросли Galdieria sulphuraria. Физиология растительной клетки. 36(4): 633-638.
- Нильс Т. Эриксен, «Производство фикоцианина — пигмента, применяемого в биологии, биотехнологии, производстве продуктов питания и медицине». Прикладная микробиология и биотехнология, 2008
Molecular Devices UK Ltd
Molecular Devices — один из ведущих мировых поставщиков высокоэффективных технологий для медико-биологических исследований. Мы делаем передовые научные открытия возможными для академических кругов, фармацевтических и биотехнологических компаний, предоставляя платформы для высокопроизводительного скрининга, геномного и клеточного анализа, отбора колоний и обнаружения в микропланшетах. От рака до COVID-19 — мы внесли свой вклад в научные прорывы, описанные в более чем 230 000 рецензируемых публикациях.
Более 160 000 наших инновационных решений используются в лабораториях по всему миру, позволяя учёным повышать производительность и эффективность, что в конечном итоге ускоряет исследования и разработку новых методов лечения. Штаб-квартира Molecular Devices находится в Кремниевой долине, штат Калифорния, а лучшие в своём классе команды работают по всему миру. Более 1000 сотрудников работают под руководством нашей разноплановой команды руководителей и женщины-президента, которые уделяют приоритетное внимание культуре сотрудничества, вовлечённости, многообразия и инклюзивности.
Чтобы узнать больше о том, как Molecular Devices помогает ускорить научные открытия, посетите сайт www.moleculardevices.com.
Политика в отношении спонсируемого контента: News-Medical.net публикует статьи и сопутствующий контент, который может быть получен из источников, с которыми у нас есть коммерческие отношения, при условии, что такой контент соответствует основному редакционному принципу News-Medical.Net, который заключается в том, чтобы просвещать и информировать посетителей сайта, интересующихся медицинскими исследованиями, наукой, медицинскими устройствами и методами лечения.
Последнее обновление: 7 августа 2023 года, 6:41 утра
Чтобы написать отзыв нужно авторизоватся