Ученые выяснили, как рыбки данио переключаются между делением клеток и прямой дифференцировкой для восстановления органов чувств, что ставит под сомнение устоявшиеся представления о регенерации тканей.
В недавнем исследовании, опубликованном в журнале Nature Communications, учёные из Института медицинских исследований Стоуэрса в США изучили механизмы, с помощью которых гены стволовых клеток регулируют регенерацию нейромастов (органов чувств) боковой линии рыбок данио. В частности, в ходе исследования с помощью новейшего метода редактирования генов CRISPR, секвенирования РНК отдельных клеток и визуализации в реальном времени было изучено, как два разных гена циклина D, ccndx и ccnd2a, регулируют различные популяции клеток во время развития и регенерации этих органов чувств.
Результаты исследования показывают, что ccndx и ccnd2a функционируют независимо друг от друга, но дополняют друг друга: первый регулирует деление клеток-предшественников, а второй усиливает пролиферацию стволовых клеток. Даже если один из путей утрачен, другой может частично компенсировать его, но регенерация происходит с помощью ограниченного и менее надёжного механизма. Например, у мутантов ccndx прямая дифференцировка может приводить к образованию волосковых клеток без деления, однако при этом образуется меньше клеток и возникает выраженный дефект полярности: примерно у 70 % регенерированных волосковых клеток наблюдается смещение в сторону задней части. Этот дефект полярности механически связан с пониженной экспрессией hes2.2, который в норме ингибирует Emx2, главный регулятор полярности волосковых клеток. Вместе эти гены обеспечивают надёжное поддержание тканей, открывая новые терапевтические направления в исследованиях по регенерации органов чувств.
Предыстория
Обновление и регенерация тканей — фундаментальные процессы, необходимые для поддержания жизни. Эти постоянно происходящие процессы зависят от тонкого баланса между популяциями стволовых клеток, которые со временем постепенно восстанавливаются, и клетками-предшественниками, которые в ответ на физиологические потребности созревают и превращаются в специализированные формы.
Десятилетия исследований показали, что белки циклин D, известные прежде всего своей ключевой ролью в регуляции клеточного цикла, оказывают существенное модулирующее воздействие на пролиферацию клеток. К сожалению, механизмы связи между конкретными популяциями стволовых клеток и использованием белков циклин D до сих пор изучены недостаточно. Раскрытие этих механизмов может открыть путь к новым методам регенеративной терапии, особенно актуальным в условиях глобального старения населения, которое сталкивается с ухудшением сенсорных способностей.
Недавнее исследование было направлено на то, чтобы с помощью данио-рерио, хорошо изученного модельного организма, известного своими регенеративными способностями, найти ответ на этот вопрос. В частности, известно, что боковая линия данио-рерио быстро восстанавливает клетки после повреждения. Эта линия состоит из волосковых, опорных и мантийных клеток, необходимых для обнаружения движения воды. Учитывая функциональную аналогию с внутренним ухом человека, эти модели используются для лучшего понимания процесса регенерации органов чувств.
Об исследовании
В настоящем исследовании для выяснения механизмов, лежащих в основе регенерации сенсорной системы боковой линии, использовались несколько трансгенных линий личинок рыбок данио. Исследование сосредоточено на двух генах циклина D: ccndx и ccnd2a.
С помощью редактирования генов CRISPR-Cas9 и CRISPR-Cas12a были получены трансгенные рыбки данио с нокаутом ccndx и/или ccnd2a, за которыми велось наблюдение (с помощью scRNA-seq) для выявления различий в экспрессии генов и клеточных состояниях. Эти исследования были проведены на 10 000 клеток и дополнены моделированием скорости РНК с помощью алгоритмов scVelo и partition-based graph abstraction (PAGA).
Исследователи начали с того, что обработали личинок рыбок данио неомицином — антибиотиком (ототоксином), который вызывает быструю гибель волосков (и последующую регенерацию) в органе боковой линии. Наблюдение с помощью анализа одноклеточной РНК (scRNA-seq) в сочетании с маркировкой 5-этинил-2'-дезоксиуридином (EdU) и покадровой визуализацией (Nikon Ti2 Eclipse; 42 часа при 28,5 °C) позволило выявить две популяции клеток с экспрессией ядерного антигена (PCNA), одна из которых регулируется ccndx, а другая — ccnd2a.
Наконец, было проведено моделирование белков с использованием платформ Robetta и Mol*3D Viewer, чтобы сравнить структурную консервативность белков циклина D у трансгенных видов рыбок данио. Статистический анализ включал дисперсионный анализ (ANOVA) и t-тесты для выявления значимых различий между группами (p < 0,05).
Результаты исследования
Анализ воздействия неомицина выявил наличие двух независимых популяций клеток, участвующих в регенерации нейромы. Анализ scRNA-seq выявил следующие популяции: 1. Самообновляющиеся популяции стволовых клеток, которые экспрессируют ccnd2a, и 2. Клетки-предшественники, которые созревают в сенсорные волосковые клетки, экспрессирующие ccndx.
Примечательно, что у нокаутных штаммов ccndx наблюдалась регенерация волос даже при отсутствии экспрессии ccndx. Тем не менее эти волосяные клетки часто были неправильно ориентированы, возможно, из-за изменённой активности hes2.2 и emx2 (генов, участвующих в формировании полярности волосяных клеток). Важно отметить, что экспрессия ccnd2a под действием промотора ccndx, искусственного генетического восстановления, смогла восстановить как количество, так и ориентацию волосковых клеток у ccndx-мутантов (p < 0,0001), что свидетельствует скорее о механистической демонстрации, чем о физиологической компенсации.
Напротив, мутанты с дефицитом ccnd2a показали сниженную усиливающую пролиферацию стволовых клеток во время развития, но регенерация была затронута в меньшей степени, что позволяет предположить, что другие циклины могут компенсировать во время восстановления тканей, не вызывая дефектов полярности. В частности, в исследовании сообщается об усилении регуляции ccnd1 во время регенерации у мутантов ccnd2a, потенциально компенсирующей потерю функции ccnd2a (Дополнительная фиг. 5N–P). Эта независимая регуляция предполагает, что сенсорная регенерация может происходить, даже если одна популяция (путь) нарушена. Например, через пять дней после оплодотворения (dpf) у мутантов ccndx наблюдалось значительное снижение количества дифференцирующихся клеток-предшественников EdU+ по сравнению с их братьями и сёстрами дикого типа (p = 0,0001), в то время как количество размножающихся клеток оставалось неизменным (p = 0,35).
Открытие того факта, что волосковые клетки рыбок данио могут регенерировать путём прямой дифференцировки без пролиферации клеток-предшественников, представляет собой смену парадигмы в регенеративной биологии и бросает вызов устоявшемуся мнению о том, что пролиферация необходима для регенерации тканей.
Наконец, это исследование показало важность «Notch-сигнализации» для регенерации органов чувств. Было обнаружено, что этот высококонсервативный путь межклеточной коммуникации, необходимый для развития и гомеостаза тканей, подавляет экспрессию ccndx, а его ингибирование приводит к усилению пролиферации клеток-предшественников только у рыб с интактным ccndx. Таким образом, подтверждается наличие тесной регуляторной связи между активностью Notch, экспрессией циклина D и способностью к регенерации.
Выводы
Это исследование представляет собой значительный шаг вперёд в нашем понимании регенеративной биологии. Оно впервые демонстрирует, что, вопреки предыдущим предположениям, не все пролиферирующие клетки в регенерирующих тканях регулируются одинаково. Исследование подчёркивает важность индивидуальной регуляции клеточного цикла с использованием как ccndx, так и ccnd2a для достижения оптимальных результатов сенсорной регенерации.
Эти результаты могут ускорить разработку методов лечения в области регенеративной медицины. Однако важно отметить, что ccndx отсутствует у млекопитающих, поэтому эти результаты применимы только к видам, не относящимся к млекопитающим. Как и в случае с другими фундаментальными научными исследованиями на животных моделях, полученные результаты следует рассматривать в контексте биологии рыбок данио, а их применимость к людям потребует дальнейших исследований.
Ссылка на журнал:
- Лаш, М. Э., Цай, Ю. Ю., Чен, С., и др. (2025). Пролиферация стволовых клеток и клеток-предшественников независимо регулируется генами циклина D, специфичными для конкретного типа клеток. Nature Communications 16, 5913. doi:10.1038/s41467-025-60251-0.
Чтобы написать отзыв нужно авторизоватся