Лидеры мнений:
Максим Молодцов, кандидат наук
Рандхир Кумар, кандидат наук
Доктор Максим Молодцов рассказал о своих исследованиях, в ходе которых он изучает механические и структурные основы роли когезина в регуляции генома, начиная с экспериментов по оптической ловушке и заканчивая пониманием механизма генерации молекулярной силы.
Какую роль играет когезин в формировании петель ДНК и сегрегации хромосом?
Когезин — это белковый комплекс, который скрепляет сестринские хроматиды и помогает формировать петли ДНК, необходимые для регуляции генов и митоза. Это кольцеобразная структура с довольно длинными спиралевидными доменами длиной около 50 нанометров, а также двумя доменами АТФазы.
Исследования моей группы сосредоточены на трёхмерной организации и физической перестройке ДНК во время клеточного цикла. Эта пространственная организация также имеет решающее значение для экспрессии генов, рекомбинации и восстановления ДНК.
При делении клеток ДНК уплотняется и образует отдельные хромосомы. Организация и разделение хромосом необходимы для точного деления клеток. Мы изучаем механические силы, которые перемещают ДНК, создают петли ДНК, перемещают их по клетке и реорганизуют в трёхмерном пространстве.
Когезин удерживает сестринские хроматиды вместе во время деления клеток. Когда когезин разрушается, хромосомы просто распадаются. Эта роль делает когезин ключевым элементом перестройки ДНК в клеточном цикле. Устойчивость когезина к воздействию митотического веретена особенно важна для этого процесса.
Считается, что форма когезинового комплекса позволяет ему удерживать цистидные ДНК с помощью особого механизма, который захватывает две цепи ДНК.
Более поздние исследования показали, что когезин может образовывать петли ДНК — одно из основных средств организации ДНК и взаимодействия клеток.
Такие методы, как подтверждение хромосом и Hi-C, доказали важность когезина в формировании петель ДНК. Они подтвердили, что при снижении уровня когезина петли ДНК начинают распадаться.
Изображение предоставлено: Billion Photos/Shutterstock.com
Как вы использовали оптические ловушки для измерения механической прочности когезина?
Наша цель состояла в том, чтобы выяснить, могут ли они, динамически связывая ДНК, противостоять силам, создаваемым митотическим веретеном.
Чтобы изучить этот процесс, мы сначала создали систему, имитирующую взаимодействие между двумя молекулами ДНК, удерживаемыми вместе когезином. Мы взяли предметное стекло и прикрепили к нему молекулу ДНК, а затем связали её с молекулой когезина.
Работа с одной молекулой важна, потому что при работе с несколькими молекулами интерпретация результатов становится очень сложной.
Мы убедились, что на каждую молекулу ДНК приходится одна молекула когезина, добавив к молекуле когезина флуоресцентную метку и измерив флуоресценцию, чтобы подтвердить её наличие. Затем мы добавили вторую молекулу ДНК с прикреплённым флуорофором, что позволило нам подтвердить её присоединение к когезину.
Чтобы имитировать напряжение, возникающее в ДНК во время митоза, мы прикасаемся стеклянной бусиной к ДНК или когезину и с помощью оптической ловушки изучаем её поведение.
В оптической ловушке используется сфокусированный лазер, направленный на конфокальное пятно на стеклянной бусине. Это создаёт сильное локализованное поле, которое позволяет точно перемещать бусину. Кроме того, это позволяет исследователям прикладывать к бусине силу и точно измерять её.
Суть этого эксперимента заключается в том, чтобы растягивать связанную с когезином ДНК до тех пор, пока она не порвётся, а затем проанализировать этот процесс, чтобы понять, что именно происходит.
Мы работаем с оптической ловушкой JPK NanoTracker 2 от Bruker, подключённой к системе удаления дёрна, чтобы визуализировать отдельные молекулы когезина, собранные в относительно стандартной проточной ячейке.
С помощью этой системы мы прикрепили молекулу ДНК к молекуле когезина и промыли её солью. По мере увеличения концентрации соли когезин диффундирует, перемещаясь по молекуле ДНК вперёд и назад. За этим процессом можно наблюдать с помощью климографа. На этом этапе когезин также обесцвечивается за один шаг, что подтверждает, что это одна молекула когезина.
Затем мы добавили вторую молекулу ДНК с флуорофором, чтобы визуализировать коррелированное движение когезина и ДНК. Мы также измерили флуоресценцию, чтобы подтвердить наличие одной молекулы.
Когда мы тянем за стеклянную бусину, ДНК растягивается. При этом мы видим, что когезин удерживает бусину, но в какой-то момент когезин разрывается, и ДНК возвращается к бусине, оставаясь целой. Этот эксперимент позволяет нам измерить силу, с которой разрывается когезин. Используя гистограмму силы разрыва, мы видим, что один когезин разрывается при силе около 20 пиконьютонов.
Что показали ваши эксперименты в отношении слабых мест в структуре когезина?
Самая простая модель, которую мы могли бы использовать для изучения взаимодействия когезина с ДНК, предполагает, что одна молекула когезина удерживает ДНК в кольцеобразной структуре. При приложении силы кольцо должно разорваться в самом слабом месте, независимо от того, как именно прикладывается сила.
В этом когезине не так много точек, которые могут разорваться, но есть клейзиновые ворота (соединение между двумя белками) через которые ДНК высвобождается в физиологических условиях.
Мы хотели выяснить, может ли ДНК покинуть это место под действием внешней силы, поэтому ковалентно связали этот интерфейс, чтобы ДНК не могла покинуть его. Наши исследования показали, что центральная сила осталась прежней, а значит, ДНК покидает это место откуда-то ещё.
Другим потенциально слабым местом является шарнир, где взаимодействуют витки ДНК. Мы провели аналогичный эксперимент, прикрепив когезины к ДНК и создав поперечные связи в шарнирах, хотя поперечные связи образовались только примерно в половине когезинов на ДНК.
Гистограмма разрывных усилий выглядела совсем иначе.
Мы увидели два пика, как и следовало ожидать от двух популяций когезинов. Примерно половина этих популяций продемонстрировала ту же силу, что и в нашем предыдущем эксперименте, то есть, скорее всего, это комплексы, которые не образовали поперечные связи. Однако другая половина показала гораздо более высокую силу разрыва, что позволяет предположить, что эти молекулы образовали поперечные связи.
Эти более высокие силы предполагают, что при закрытии этого интерфейса разрушается другой, гораздо более прочный интерфейс. Таким образом, ДНК не может легко высвободиться, поскольку прочные ковалентные связи соединяют её с когезином.
Мы также повторили эксперимент с использованием второй молекулы ДНК. На этот раз мы загрузили вторую цепь и убедились, что одна молекула когезина удерживает обе молекулы ДНК вместе, прежде чем приложить силу и измерить результирующую силу разрыва.
В этом случае мы обнаружили, что силы разрыва были примерно одинаковыми, но распределение было немного смещено. Мы поняли, что при растяжении двух цепочек ДНК разрыв происходит дольше из-за того, что ДНК длиннее. Если прикладывать силу в течение более длительного времени, связь разорвётся при меньшей силе.
Теперь мы считаем, что когезин удерживает сестринские хроматиды вместе, физически связывая их, и что это физическое связывание может быть разорвано под действием силы примерно в 20 пиконьютонов. Мы полагаем, что расцепление этого когезинового кольца и действие этой силы могут быть важным механическим регуляторным механизмом.
Например, во время митоза или NFA когезин должен быть расщеплен сепаразой, чтобы позволить хромосомам разделиться. Этот процесс обратим, но в других случаях когезин должен быть полностью удален, чтобы позволить ДНК сомкнуться обратно.
Мы также знаем, что хромосомы иногда «дышат», чтобы позволить когезину загружаться и разгружаться. Эта механическая разгрузка может быть важна и в других процессах, например во время репликации, когда когезин нужно разгрузить, а затем снова загрузить на репликационной вилке. Отчасти этот процесс может быть связан с механической регуляцией, когда шарнирный интерфейс разъединяется, позволяя крупным механизмам проходить, соединяться и снова разъединяться.
В целом мы считаем, что это механическое разъединение может быть частью процесса регуляции, при котором механическая сила регулирует нагрузку на когезин, связанную с ДНК.
Как конформационные изменения когезина влияют на его функцию молекулярного мотора?
Когезин — это хорошо изученная молекулярная машина, которая может выдавливать эти петли ДНК, но механизм, с помощью которого она это делает, до сих пор в значительной степени неизвестен.
Одно из фундаментальных свойств этих механизмов заключается в том, что они должны быть способны связывать конформационные изменения с циклом гидролиза и движением вдоль ДНК.
Мы хотели выяснить, могут ли различные конформационные изменения в когезине создавать силу, чтобы понять, как эти изменения могут способствовать перемещению когезина вдоль ДНК.
В кольце когезина происходят два основных конформационных изменения. Одно из них называется «от головы к голове», когда головной домен перемещается вперёд и назад, а другое — «от шарнира к голове».
Общие молекулы когезина отслеживались с помощью двух меток. Одну метку мы использовали для мобилизации когезина на поверхности, а другая метка с помощью пассивной катушки отделяла когезин от шарика и ловушки.
Мы прикрепили шарик, удерживаемый в оптической ловушке, чтобы приложить силу к когезину. Ключевым преимуществом этого эксперимента было то, что система позволяла нам точно отслеживать, как конформационные изменения в когезине зависят от приложенной силы. Например, если шарнир наклоняется к головке, шарик должен двигаться вместе с шарниром, и мы сможем зафиксировать это движение.
Нам удалось собрать данные, соответствующие когезинам согнутых и разогнутых шарниров. Расстояние, рассчитанное на основе этих данных, примерно соответствовало тому, что мы ожидали получить на основе структурных данных. Это указывает на то, что мы наблюдали за тем, как происходит изгиб шарнира в реальном времени.
Что касается зависимости этих изгибов от внешней силы, мы увидели, что когезин остаётся практически неподвижным при силе около 1,5 пиконьютона, но при силе около одного пиконьютона и даже меньше он изгибается вперёд и назад.
Эта динамика напомнила нам о влиянии броуновского движения, которое, скорее всего, и является причиной этого движения, а не каких-то химических процессов. Нам нужно проверить эту идею и выяснить, действительно ли изгиб и разгиб происходят из-за тепловых колебаний.
Мы сопоставили наши данные с простой моделью с тремя состояниями, чтобы оценить, вызваны ли эти переходы между полностью согнутым, наполовину согнутым и полностью разогнутым состояниями тепловыми флуктуациями. Модель очень хорошо соответствует нашим данным, что позволяет предположить, что это движение вызвано тепловыми, броуновскими флуктуациями.
Следующий вопрос, который мы задали: «Для чего в данном случае нужен гидролиз АТФ и какое движение он обеспечивает?». Мы изучили движение «голова к голове», используя ту же установку для измерения создаваемых сил. Для этого мы зафиксировали одну голову и вместо того, чтобы тянуть за шарнир, потянули за голову.
Этот эксперимент показал совершенно иную картину. Движение «голова к голове» происходило при гораздо более высоких усилиях, например, при пяти пиконьюнтах и 10 пиконьюнтах, при этом размер движения составлял около 10 нанометров. Это именно то, что мы ожидаем увидеть на основе структурных данных, и это согласуется с измерениями других групп с использованием атомно-силового микроскопа.
Что было интересно в этом эксперименте, так это то, что не имело значения, какую силу мы прикладывали в определённом диапазоне (до 15 пиконьютонов). Скорость, с которой открывались и закрывались домены этой молекулы, практически не зависела от приложенной внешней силы, в отличие от экспоненциальной зависимости от силы, которую мы ожидаем в случае теплового броуновского храповика.
Эти данные свидетельствуют о том, что это движение отличается от движения «шарнир-голова». Оно обусловлено химическими переходами, а не тепловыми броуновскими флуктуациями, то есть, скорее всего, за это движение отвечает цикл АТФ.
Таким образом, существуют два основных конформационных изменения, которые создают силу за счёт двух разных механизмов. Сгибание шарнира головки в основном происходит за счёт тепловых флуктуаций, но движение головки в основном обусловлено химическими процессами и может создавать гораздо большую силу.
В настоящее время мы не знаем, зачем нужны два разных механизма генерации силы в одной молекуле, но одна из наших гипотез заключается в том, что при экструзии петли мы на самом деле наблюдаем два процесса. Сначала нам нужно согнуть ДНК, чтобы инициировать образование петли, а затем вытянуть её. Возможно, эти два механизма отвечают за разные фазы экструзии петли: один — за вытягивание, другой — за разделение.
Что такое NanoTracker и как он улучшает результаты экспериментов с оптическим пинцетом?
NanoTracker — это усовершенствованная система полностью моторизованного оптического пинцета с возможностью измерения силы и положения с высоким разрешением.
Это вторая версия устройства. NanoTracker создан на основе инвертированного микроскопа, который можно интегрировать с различными видами световой микроскопии, включая флуоресцентную, конфокальную, TIF и TIC. Он также поддерживает микроскопы многих производителей, таких как JICE, Nikon, Olympus и Leica.
NanoTracker оснащен удобной программной платформой с возможностями автоматизации, функцией пропуска записи для режимов спектрометрии, а также CMOS- и CCD-камерами для визуализации образцов. Все устройство автоматизировано: пользователю нужно только поместить образец, а все остальное выполняется автоматически с помощью программного контроллера.
NanoTracker может измерять силы до 100 или 200 пиконьютонов. Это зависит от мощности используемого лазера и разрешения в 0,1 пиконьютона. Мы можем не только измерять силы, действующие на частицу, но и отслеживать её положение с субнанометровым разрешением.
NanoTracker также обеспечивает высокую скорость сбора данных в мегагерцах и поддерживает большую пропускную способность. Он поддерживает работу с одной, двумя и несколькими ловушками, а управление несколькими ловушками осуществляется с помощью настройки времени, при которой время распределяется между разными ловушками. Однако время, выделенное для каждой ловушки, настолько мало, что ловушки не регистрируют никаких прерываний.
Количество улавливаемых частиц ограничено только мощностью используемого лазера. Например, с помощью одной ловушки мы можем улавливать до 255 частиц. Это лазерный прибор первого класса, поэтому вам не понадобятся дополнительные защитные очки или лаборатория, оборудованная средствами лазерной безопасности. Система поставляется с двумя вариантами мощности лазера: 3 Вт и 5 Вт. Длина волны лазера составляет 1064 нанометра.
Для использования с чашками Петри диаметром 35 мм доступен нагреватель для чашек Петри. Образцы можно нагревать до 45 °C, а функция газовой перфузии идеально подходит для пользователей, работающих с живыми клетками в ходе длительных экспериментов.
Ещё один полезный аксессуар для работы с образцами — магнитный твистер, который идеально подходит для улавливания магнитных частиц и нанесения токсинов для изучения их воздействия.
Не могли бы вы описать, как ламинарный бокс используется для растяжения ДНК?
Ламинарные проточные ячейки NanoTracker имеют пять входных и один выходной канал. Это означает, что в прибор можно подавать пять разных жидкостей, что позволяет проводить различные эксперименты в разных каналах без смешивания жидкостей.
Например, в один канал можно направить шарики, покрытые стрептавидином, а в другой — биотинилированные молекулы ДНК. Это позволяет нам использовать флуоресцентную in situ гибридизацию (FISH) для молекул ДНК, чтобы провести эксперимент по растяжению ДНК.
В этом типе эксперимента используются две ловушки, между которыми находится молекула ДНК. Одна часть ДНК (в первой ловушке) неподвижна, а другая часть ДНК (во второй ловушке) движется. Когда мы перемещаемся во вторую ловушку, мы можем зафиксировать силы, действующие на ДНК.
Установка для этого эксперимента начинается с контроллера, который используется для управления всей электроникой в системе. Он также постоянно обменивается данными с компьютером для их записи и хранения.
Сверху на контроллере расположены блок питания лазера и блок управления лазером. Различные оптические элементы создают множество ловушек и позволяют управлять ими или модулировать их. Затем свет направляется по оптическому пути к головке микроскопа, установленной на перевернутом микроскопе Zeiss. Свет проходит через дихроичное зеркало, расположенное под углом 45°, а затем через объектив с высоким числовым значением апертуры.
Принцип работы этой установки заключается в том, что лазерный луч фокусируется, захватывая частицу, а затем с помощью другого объектива определяется положение частицы или приложенные к ней силы с помощью квадрантного фотодиода. Этот метод называется интерферометрией в задней фокальной плоскости.
С помощью программного обеспечения NanoTracker мы можем настроить мощность лазера и распределить её между ловушками. Мы можем использовать фильтр ослабления, чтобы избежать перенасыщения детектора.
Окно позволяет использовать либо объектив для обнаружения, либо объектив для улавливания частиц, что обеспечивает точную настройку фокальной плоскости для улавливания частиц. В NanoTracker также предусмотрены моторизованные предметные столики, обеспечивающие очень точное перемещение. Это включает в себя нанопозиционирование предметных столиков во всех трёх направлениях (x, y, z) с точностью до 100 микрометров.
Функционал силового спектрометра NanoTracker идеально подходит для этой задачи, поскольку мы хотим растянуть ДНК, а затем измерить силу, действующую на неё.
Прежде чем измерять силу, нам нужно откалибровать оптический пинцет с помощью метода спектра мощности. Нам также нужно задать диаметр используемой частицы, температуру, а также плотность и вязкость среды, в которой находятся частицы. Калибровка спектра мощности для ловушки заключается в его аппроксимации функцией Лоренца. Правильная калибровка позволяет нам определить такие параметры, как чувствительность и жёсткость ловушки.
В качестве примера эксперимента с использованием этой установки мы создали две ловушки: одну статическую, а другую подвижную. Мы настроили подвижную ловушку так, чтобы она удлиняла ДНК на 12 микрометров со скоростью один микрометр в секунду. Мы также настроили частоту выборки данных в соответствии с этим параметром.
После проведения силовой спектрометрии мы можем открыть первую вкладку спектрометра и выбрать канал для просмотра, который может быть либо первым, либо вторым. В данном случае мы выбираем сигнал из статической ловушки.
ДНК порвалась, как только мы удлинили её примерно на 7,8–7,9 микрометра. Об этом свидетельствовали результаты силовой спектроскопии, которые вернулись к нулю.
Как система определяет, что ДНК успешно закреплена между двумя шариками?
Как только приложенная сила (которую измеряет система) превышает пороговое значение при движении одной из ловушек, мы понимаем, что ДНК успешно захвачена.
Например, в одном канале установки с ламинарным потоком находятся полистироловые шарики диаметром 3 микрометра или 3,2 микрометра, покрытые стрептавидином и лямбда-ДНК, покрытой биотином. Биотин связывается со стрептавидином, прикрепляя ДНК к шарикам.
Как только ловушка сработает, мы сможем поймать эти шарики. Если предположить, что одна ловушка неподвижна, а другая движется по кругу в поисках ДНК, мы можем использовать скрипт для измерения силы, с которой движущаяся ловушка вращается с шагом в 0,1 микрометра. Если зафиксированная сила превышает базовое значение более чем на 20 пиконьютонов, это означает, что ДНК захвачена и можно приступать к спектроскопическим измерениям.
Для таких экспериментов полезны такие инструменты, как конструктор рамп NanoTracker. Кроме того, эксперименты можно автоматизировать с помощью планировщика экспериментов или создавая собственные скрипты на Java или Python.
Можно ли интегрировать NanoTracker с другими инструментами, такими как атомно-силовой микроскоп, и как это сделать?
Оптические измерения слежения можно проводить одновременно с атомно-силовыми измерениями. На платформе COMBI NanoTracker есть объектив для улавливания частиц, и после снятия головки NanoTracker мы можем установить поверх него атомно-силовой микроскоп.
Некоторые пользователи уже проводили подобные эксперименты, чтобы измерить взаимодействие между различными типами клеток.
О спикерах
Максим получил степень магистра в Московском государственном университете имени М. В. Ломоносова и защитил кандидатскую диссертацию в 2007 году после исследования сил, действующих на микротрубочки, в Колорадском университете в Боулдере. Позже он работал в Российской академии наук, а затем занимался постдокторантурой в Институте молекулярной патологии в Вене, где участвовал в разработке инструментов для высокоскоростной 3D-визуализации и изучал архитектуру генома. С 2018 года он возглавляет группу в Институте Фрэнсиса Крика и работает по совместительству в Университетском колледже Лондона
Обладая более чем пятилетним опытом исследований, Рандхир Кумар привносит глубокие знания в области оптики, фотоники и биофизики в промышленное применение. В компании Bruker он специализируется на разработке и калибровке передовых оптических систем, а также на создании 3D-микроструктур с помощью двухфотонной полимеризации на основе фемтосекундных лазеров. Будучи командным игроком, способным адаптироваться к новым условиям, он поддерживает международные научные проекты и помогает внедрять инновации в командах разработчиков, специалистов по продажам и применению.
О наноповерхностях и метрологии Bruker
Bruker Nano Surfaces and Metrology предлагает высокопроизводительные специализированные технологии анализа и тестирования для широкого спектра исследовательских и производственных задач.
Наш широкий ассортимент 2D- и 3D-профилографов предоставляет конкретную информацию, необходимую для проведения исследований и разработок, контроля качества и измерения поверхности, а также для быстрого, точного и простого решения этих задач. А наши трибометры и механические тестеры предоставляют практические данные, которые помогают совершенствовать разработку материалов и трибологических систем. Ведущие в отрасли приборы для количественных наномеханических и нанотрибологических испытаний Bruker специально разработаны для того, чтобы открыть новые горизонты в области определения характеристик наноразмерных материалов, их разработки и мониторинга процессов.
Компания Bruker с самого начала лидировала в расширении возможностей атомно-силового микроскопа (АСМ), и наши системы являются самыми востребованными АСМ в мире. Наш обширный набор АСМ позволяет учёным по всему миру совершать открытия и углублять свои знания о материалах и биологических системах.
Благодаря нашей технологии nanoIR компания Bruker теперь также является признанным лидером в области фототермической ИК-спектроскопии - от наноразмерной до субмикронной и макромасштабной. Кроме того, Bruker, как единственный производитель АСМ, располагающий современным оборудованием для производства зондов и международной поддержкой клиентов в зависимости от конкретного применения, обладает уникальными возможностями для предоставления оборудования, руководства и поддержки для всех ваших потребностей в исследованиях на наноуровне.
Набор систем флуоресцентной микроскопии Bruker предлагает полный спектр решений для исследователей в области наук о жизни. Наши системы многофотонной визуализации обеспечивают глубину, скорость и разрешение, необходимые для прижизненной визуализации, а наши конфокальные системы позволяют клеточным биологам изучать функции и структуру с помощью визуализации живых клеток с невиданной ранее скоростью и длительностью.
Микроскопы сверхвысокого разрешения Bruker устанавливают новые стандарты благодаря количественной локализации отдельных молекул, которая позволяет напрямую исследовать положение молекул и распределение белков в клеточной среде. А наши микроскопы Luxendo совершают революцию в долгосрочных исследованиях в области биологии развития и изучении динамических процессов в клеточных культурах и на моделях мелких животных.
Помимо разработки и производства систем нового поколения для текущих и будущих задач наших клиентов, компания Bruker активно сотрудничает с инновационными компаниями, чтобы продолжать расширять спектр технологий и решений. Недавно в семейство Bruker Nano Surfaces вошли компании Alicona Imaging, Anasys Instruments, Hysitron, JPK Instruments и Luxendo.
Какие бы задачи по измерению и анализу вам ни стояли, какой бы ни был материал или масштаб исследования, у Bruker найдётся для вас специализированное высокопроизводительное решение.
Политика в отношении спонсируемого контента: News-Medical.net публикует статьи и сопутствующий контент, который может быть получен из источников, с которыми у нас есть коммерческие отношения, при условии, что такой контент соответствует основной редакционной политике News-Medical.Net, которая заключается в обучении и информировании посетителей сайта, интересующихся медицинскими исследованиями, наукой, медицинскими устройствами и методами лечения.
Чтобы написать отзыв нужно авторизоватся