Сокращение числа терапевтических препаратов часто может быть связано с отсутствием трансляционной эффективности на этапе от доклинической фазы до клиники. Органоиды демонстрируют значительный потенциал для изменения подхода к моделированию заболеваний и скринингу лекарств, поскольку они очень похожи на ткани по структуре и функциям и демонстрируют более предсказуемую реакцию на лекарства. Однако при попытке широкомасштабного применения органоидов возникают проблемы, связанные со сложностью анализа, воспроизводимостью и ограниченной возможностью масштабирования. Это несколько ограничивает их использование в качестве основного метода скрининга при разработке лекарств.
Для предотвращения узких мест, связанных с трудоемкими ручными протоколами, компания Molecular Devices UK разработала CellXpress.ai Автоматизированную систему культивирования клеток. Эта мощная рабочая станция автоматизирует весь процесс культивирования органоидов для создания расширенных и сложных рабочих процессов.
Система CellXpress.ai может выполнять такие задачи, как смена среды, посев, пассаж, мониторинг органоидов и выполнение конечных анализов, а также анализ сложных изображений. В этой статье представлены результаты автоматизации нескольких часто используемых протоколов культивирования органоидов, включая выращивание 3D-органоидов в матричных куполах.
В ходе этого исследования здоровые кишечные органоиды культивировались, пассировались и размножались в чашках Петри с Matrigel® (24-луночные). Культивирование органоидов осуществлялось с помощью автоматизированной замены среды и контролировалось каждые 24 часа с помощью визуализации на основе машинного обучения. Через 5–6 дней органоиды автоматически собирались, очищались от Matrigel перед диспергированием, затем смешивались со свежим Matrigel и повторно высевались.
Впоследствии органоиды смогли самоорганизоваться и развить сложные крипты. Для определения количества органоидов, их размера (по площади) и оптической плотности органоиды наблюдали в проходящем свете и оценивали с помощью анализа изображений на основе машинного обучения. Для анализа конечной точки (96-луночный планшет) органоиды окрашивали маркерами жизнеспособности и проверяли на предмет зависимости от концентрации и времени воздействия соединений на здоровые органоиды кишечника (оценка токсичности) или органоиды колоректального рака, полученные от пациентов (скрининг лекарств).
Автоматизированные процессы культивирования клеток, поддерживаемые визуализацией и принятием решений на основе машинного обучения, обладают значительным потенциалом для вывода 3D-биологии на новый уровень, способствуя повышению производительности и воспроизводимости при разработке лекарств и моделировании заболеваний.
Методы
Контрольно - измерительные приборы
Компания Molecular Devices UK разработала совершенно новую, мощную автоматизированную систему культивирования клеток CellXpress.ai, которая позволяет автоматизировать весь процесс культивирования клеток с помощью интегрированного инкубатора, системы обращения с жидкостями и принятия решений на основе изображений. Этот автоматизированный подход позволяет управлять сложными режимами кормления и пассирования, отслеживая развитие клеточных культур с помощью периодической визуализации и анализа, а также использовать машинное обучение для запуска любых этапов пассирования, анализа конечных точек или устранения неполадок.
Флуоресцентные (FL) изображения были получены с помощью конфокальной системы визуализации высокого разрешения ImageXpress® Confocal HT.ai (Molecular Devices) в сочетании с программным обеспечением MetaXpress® для получения и анализа изображений высокого разрешения. Для кишечных органоидов изображения в формате Z-stack были получены с помощью объективов 4X или 10X в конфокальном режиме. Для всех видов анализа использовалось программное обеспечение MetaXpress или IN Carta® для анализа изображений.
Протоколы культивирования клеток
Компания Molecular devices UH разработала протокол для получения 3D-кишечных органоидов*, которые были получены из первичных клеток кишечника мыши с использованием существующих методов (STEMCELL Technologies). Клетки культивировались и дифференцировались в соответствии с протоколом STEMCELL Technologies. Для культивирования клеток использовалась среда для выращивания органоидов IntestiCult™ (STEMCELL Technologies).
Клетки высевали в культуральные чашки с 50%-ным содержанием фактора роста Matrigel или Cultrex (Corning) в формате 24-луночного планшета. Затем их каждые два дня подкармливали свежей средой в течение 7–10 дней. Затем кишечные органоиды пассировали, диссоциировали и повторно высевали в свежие культуральные чашки с Matrigel.
Автоматизация культивирования органоидных клеток
Культура органоидов в матригельных куполах была получена в соответствии с базовым протоколом STEMCELL Technologies для органоидов кишечника мыши. Органоиды выращивались и пассировались в 24-луночных планшетах с одним куполом объёмом 40–50 мкл, 50–60 % матригеля или Cultrex.
Выращивание органоидов было начато с органоидов, помещённых в Matrigel, который был помещён в предварительно охлаждённый 96-луночный планшет. Суспензию набирали с помощью четырёх наконечников для пипеток и помещали в 24-луночный планшет, по четыре наконечника за раз. Также было протестировано выращивание в 96-луночном формате.
Питание органоидов осуществлялось путём удаления отработанной среды и добавления свежей среды в четыре лунки одновременно. Визуализация/мониторинг органоидов проводились в проходящем свете с использованием автоматизированной системы культивирования клеток CellXpress.ai с 2-кратным или 4-кратным увеличением. Анализ изображений проводился с использованием протокола на основе машинного обучения. Анализ позволил оценить количество органоидов, среднюю и общую площадь, плотность и ряд других показателей.
Прохождение органоидов было установлено на каждые четыре дня, либо по указанию пользователя, либо на основе автоматического принятия решений, определяемых одним или несколькими выбранными показателями (например, общей площадью или плотностью органоидов).
Автоматизированная система культивирования клеток CellXpress ai
Прохождение органоидами этапов культивирования было выполнено с использованием различных этапов пипетирования и внешней центрифугирования, что позволило оптимизировать рабочий процесс с мышиными органоидами. Изменение скорости потока, этапов пипетирования и их повторений, скорости центрифугирования и т. д. может быть выполнено путем изменения необходимых этапов «тонкой настройки».
Для процесса пассирования было выполнено удаление среды, а купола Matrigel были инкубированы с использованием реагента для диссоциации клеток Gentle, после чего купола Matrigel были разрушены с помощью тщательного пипетирования. Смесь была перенесена в 96-луночный планшет. Затем было выполнено объединение двух лунок в одну с последующим центрифугированием на внешней центрифуге со скоростью 400 g в течение пяти минут.
Затем блок был перемещён, среда удалена, а органоиды промыты один раз. После повторного центрифугирования большая часть надосадочной жидкости была удалена, а затем с помощью наконечников меньшего размера органоиды были разрушены путём тщательного пипетирования. Затем в соответствующий объём был добавлен свежий Matrigel, перемешан и перенесён в новую чашку. Окрашивание/визуализация органоидов для анализа конечной точки проводилась с помощью флуоресцентной визуализации на приборе ImageXpress Confocal HT.ai.
Автоматизированный рабочий процесс с органоидами
- Посев семян
Автоматизация 3D-культивирования кишечных органоидов с использованием автоматизированной системы культивирования клеток
Купола Matrigel автоматически позиционируются, а суспензия внеклеточного матрикса смешивается с органоидами (клетками). Купола с посеянными клетками помещаются в планшеты с 24 лунками, инкубируются, а затем переносятся в инкубатор и возвращаются на платформу для добавления других сред.
- Обмен медиафайлами
Автоматизация 3D-культивирования кишечных органоидов с использованием автоматизированной системы культивирования клеток
Извлеките носитель и вставьте новый носитель. Задайте протокол процесса, чтобы он повторялся каждые «X» часов.
- Мониторинг
Пользователь определяет стандартные протоколы визуализации. Анализ изображений в реальном времени осуществляется с помощью предварительно обученной модели на основе глубокого обучения (или индивидуальной модели). Инструменты анализа данных позволяют отслеживать рост органоидов с течением времени. Результаты можно использовать для активации других процессов/протоколов.
- Проходящий
Удалите среду и извлеките органоиды из ECM. Проведите внешнюю центрифугизацию для фрагментации органоидов. Внесите новую среду ECM/Matrigel и посейте в новую лунку.
Этапы рабочего процесса, включающие засев, смену среды, мониторинг и пассаж кишечных органоидов, запланированы в соответствии с заданными «фазами» протокола. Первая фаза — засев, который включает в себя этап помещения органоидов Matrigel в планшеты на 24 лунки. Следующая фаза протокола включает этапы кормления/мониторинга/пассажа с заданными пользователем временем и параметрами.
Рисунок 4. Этапы протокола культивирования органоидов и пассажа. Изображение предоставлено: Molecular Devices UK Ltd
Результаты
В этом исследовании непрерывная культура кишечных органоидов выращивалась более месяца. Автоматизированное засевание органоидных куполов обеспечивало одинаковый размер и точное расположение куполов в 24-луночных планшетах, что упрощало и повышало точность визуализации и анализа изображений. Органоиды росли, как и ожидалось, в течение всего процесса автоматизированного культивирования, образуя выступы в соответствии с типичной морфологией кишечных органоидов.Во всех лунках распределение и количество органоидов оставались неизменными.
Изображения снимались ежедневно с помощью 2-кратного объектива, а анализ изображений проводился с помощью предварительно обученной модели машинного обучения. Анализ изображений позволяет находить органоиды и определять их количество, плотность, округлость, зернистость и другие морфологические критерии, включая средние значения и общую площадь.
Программное обеспечение позволяет легко просматривать органоидные купола на протяжении всего процесса культивирования и предлагает анализ в реальном времени и графики изменения во времени, представляющие различные измерения. Данные также можно экспортировать в таблицу Excel для дальнейшего анализа. На рисунке 6 показаны изменения в площади органоидов и их количестве с течением времени.
Краткие сведения
Органоидные технологии меняют правила игры в области моделирования заболеваний и скрининга лекарственных препаратов, поскольку они ближе к тканям по структуре и функциям и демонстрируют более предсказуемую реакцию на лекарства.
Проблемы, которые могут возникнуть при повсеместном внедрении органоидов, такие как сложность анализа, отсутствие воспроизводимости и возможности масштабирования скрининга, несколько ограничивают их использование в качестве основного метода скрининга при разработке лекарств.
Однако это исследование показывает, как исследователи могут устранить некоторые препятствия, связанные с трудоемкими и сложными протоколами, чтобы повысить производительность при скрининге лекарств.
Новое и мощное решение CellXpress.ai «Автоматизированная система культивирования клеток» позволяет лабораториям автоматизировать весь процесс культивирования клеток — от сборки анализатора до скрининга и анализа данных — с помощью рабочих процессов на основе машинного обучения, которые обеспечивают более надёжные и воспроизводимые анализы.
Автоматизированные процессы культивирования клеток, основанные на визуализации и принятии решений с помощью машинного обучения, демонстрируют значительный потенциал для вывода 3D-биологии на новый уровень за счёт повышения производительности и воспроизводимости, а также возможности широкого применения в высокопроизводительном поиске лекарств и точной медицине.
О компании Molecular Devices UK Ltd
Molecular Devices — один из ведущих мировых поставщиков высокоэффективных технологий для медико-биологических исследований. Мы делаем передовые научные открытия возможными для академических кругов, фармацевтических и биотехнологических компаний, предоставляя платформы для высокопроизводительного скрининга, геномного и клеточного анализа, отбора колоний и обнаружения в микропланшетах. От рака до COVID-19 — мы внесли свой вклад в научные прорывы, описанные в более чем 230 000 рецензируемых публикациях.
Более 160 000 наших инновационных решений используются в лабораториях по всему миру, позволяя учёным повышать производительность и эффективность, что в конечном итоге ускоряет исследования и разработку новых методов лечения. Штаб-квартира Molecular Devices находится в Кремниевой долине, штат Калифорния, а лучшие в своём классе команды работают по всему миру. Более 1000 сотрудников работают под руководством нашей разноплановой команды руководителей и женщины-президента, которые уделяют приоритетное внимание культуре сотрудничества, вовлечённости, многообразия и инклюзивности.
Чтобы узнать больше о том, как Molecular Devices помогает ускорить научные открытия, посетите сайт www.moleculardevices.com.
Политика в отношении спонсируемого контента: News-Medical.net публикует статьи и сопутствующий контент, который может быть получен из источников, с которыми у нас есть коммерческие отношения, при условии, что такой контент соответствует основному редакционному принципу News-Medical.Net, который заключается в том, чтобы просвещать и информировать посетителей сайта, интересующихся медицинскими исследованиями, наукой, медицинскими устройствами и методами лечения.
Последнее обновление: 5 августа 2024 года, 4:46 утра
Чтобы написать отзыв нужно авторизоватся